Analisi dell’intero proteoma di un ceppo di Listeria monocytogenes esposto a differenti fattori di stress

Listeria monocytogenes è l’agente eziologico della listeriosi umana, malattia caratterizzata da un elevato tasso di letalità e determinata prevalentemente dall’ingestione di alimenti contaminati, come latte crudo e prodotti lattiero-caseari, prodotti a base di carne, prodotti della pesca, frutta e vegetali, ma soprattutto prodotti pronti al consumo (RTE, Ready To Eat). Microrganismo ubiquitario, capace di sopravvivere a fattori stressanti (per esempio ambiente acido e osmotico, e alte temperature), è un patogeno opportunista intracellulare che induce la propria internalizzazione in diversi tipi di cellule (macrofagi, cellule epiteliali, endoteliali e nervose, fibroplasti ed epatociti). Il seguente studio ha come obiettivo l’analisi dell’intero proteoma di un ceppo 1/2a di L. monocytogenes isolato da un prodotto a base di carne, al fine di identificare gli antigeni coinvolti nei pathways di virulenza del patogeno. Il ceppo è stato coltivato a quattro differenti combinazioni di pH, temperatura e concentrazione salina (NaCl%): A-controllo) 37°C, pH 7,0, NaCl 0,5%; B) 37°C, pH 5,5, NaCl 7%; C) 12°C pH 7, NaCl 0,5%; D) 12°C, pH 5,5, NaCl 7%. Per ciascuna condizione sono stati allestiti triplicati biologici e tecnici. Le cellule batteriche in fase esponenziale (O.D.=600nm) sono state raccolte e lavate con Phosphate Buffer Saline (PBS) 0.1 M mediante centrifugazione (4,600 g a 4°C). Le proteine sono state estratte con CelLytic B Cell Lysis Reagent e e CelLytic IB Inclusion Body Solubilization Reagent, precipitate mediante acido tricloroacetico (TCA) 6,1 N, lavate con acetone, risolubilizzate in “solubilization buffer” (10 mM Tris-HCl pH7.5, 200 mM NaCl) e quantificate mediante Pierce BCA protein Assay Kit. Gli estratti proteici sono stati elaborati mediante elettroforesi monodimensionale su gel di poliacrilammide in presenza di sodio dodecil solfato (1D SDS-PAGE), visualizzati mediante colorazione con Blue di Coomassie e analizzati mediante Immunoblot (IB), incubando le membrane con sieri ovini positivi e negativi per L. monocytogenes, al fine di identificare immunocomplessi antigene-anticorpo (ICs-Ag- Ab) specifici per ciascuna condizione di crescita. I profili proteici ottenuti mediante 1D SDS-PAGE risultano essere complessi e significativamente differenti in funzione delle condizioni di crescita alle quali il microrganismo era esposto. I risultati ottenuti con l’IB evidenziano la presenza di specifici ICs-Ag-Ab a 35 kDa per le condizioni A, B e C, a 45 kDa per C, a 55 kDa e 60 kDa per D e a 80 kDa per B. Le analisi preliminari del proteoma di L. monocytogenes evidenziano l’espressione di diversi pattern proteici nello stesso ceppo coltivato con differenti combinazioni di fattori di stress. La capacità del patogeno di sopravvivere e moltiplicarsi ad ampi range di temperatura, pH e concentrazione salina, contribuisce a renderlo ubiquitario e a farlo sopravvivere negli ambienti di lavoro delle aziende alimentari. Al fine di caratterizzare l’intero proteoma espresso nelle differenti condizioni e identificare specifici biomarker di virulenza coinvolti nella patogenesi della listeriosi, saranno condotte ulteriori analisi mediante spettrometria di massa tandem (UHPLC-MS/MS). I risultati saranno sottoposti a data analysis mediante differenti software di bioinformatica al fine di sub-localizzare le proteine e individuare eventuali biomarker di immunogenicità.