Methylation sensitive Alu PCR: nuovo metodo per l’analisi della metilazione del DNA in singoli ovociti umani.

La metilazione del DNA è una modifica epigenetica che generalmente si oppone alla trascrizione. La distribuzione dei dinucleotidi “metilabili” lungo i cromosomi di mammifero non è uniforme ma localizzata in regioni ricche di CG, chiamate Isole CpG (CGI), associate ai processi di imprinting genomico e di regolazione trascrizionale. Nei mammiferi, la metilazione del DNA è riprogrammata nelle cellule germinali precoci e dopo la fecondazione. Durante l’oogenesi murina è stata osservata una nuova metilazione del DNA, la cui funzione è tuttora sconosciuta. La mancanza di una metodica quantitativa e sensibile impedisce l’identificazione di eventuali alterazioni epigenetiche su larga scala nei singoli ovociti umani. Infatti, la letteratura corrente indica soltanto rari casi di alterazioni epigenetiche che, in seguito a fecondazione in vitro, sono coinvolte in difetti legati all’imprinting genetico. La methylation-sensitive PCR (MS-PCR) è una metodica in grado di individuare la presenza di DNA metilato mediante l’utilizzo di un enzima di restrizione sensibile alla metilazione seguito dalla reazione a catena della polimerasi. L’analisi della metilazione delle sequenze Alu, coinvolte nel riarrangiamento dei cromosomi e nella regolazione trascrizionale, permette di valutare la metilazione di circa il 10-30% dei dinucleotidi CpG presenti nel genoma umano. La percentuale di metilazione delle sequenze Alu è stata valutata in singoli ovociti umani prelevati da pazienti sottoposte a protocollo di stimolazione e successivamente denudati. Metà del DNA estratto da singolo ovocita è stato digerito con l’enzima di restrizione sensibile alla metilazione FauI. 1/5 di ogni campione è stato amplificato mediante PCR utilizzando primers disegnati specificatamente per le sequenze Alu. Concentrazioni scalari di DNA umano estratto da sangue o da ovocita già degenerato dopo il prelievo ovocitario sono state amplificate per ottimizzare le condizioni di amplificazione. Per ottenere un valore semi-quantitativo di DNA metilato, quindi protetto dall’attività dell’enzima di restrizione, l’intensità della banda è stata comparata all’input, corrispondente alla stessa quantità di DNA estratto dallo stesso ovocita non sottoposto alla digestione enzimatica. La MS-Alu PCR è stata poi condotta su 5 ovociti in stadio MII in seguito a denudamento e su 5 ovociti maturati in vitro entro le 24 ore a partire da stadio MI (IVM). Gli ovociti MII hanno mostrato una forte ipometilazione delle sequenze Alu rispetto agli ovociti IVM, dove più di metà delle sequenze Alu risultava metilata (13,5% ± 11,8% vs 72,5% ± 15%; p<0.005). E’ noto come le modifiche epigenetiche siano coinvolte nel compattamento dei cromosomi, oltre ai processi di imprinting genetico. Le sequenze Alu, quando non metilate, legano componenti del complesso Cohesin, responsabile dell'adesività dei cromatidi fratelli. La metilazione delle sequenze Alu in seguito a maturazione in vitro, quindi, suggerisce come durante la maturazione ovocitaria sia possibile un’estesa aberrazione epigenetica che può essere associata ad aberrazioni del fuso mitotico e aneuploidia. Ulteriori studi chiariranno il ruolo delle sequenze Alu nella maturazione ovocitaria.[...]